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          一種簡單快速的miRNA檢測新方法

          作者: 時(shí)間:2013-12-31 來源:網(wǎng)絡(luò) 收藏
            背景:MicroRNAs(miRNAs)是近年來發(fā)現(xiàn)的在進(jìn)化上高度保守的一類非編碼小RNA(~22nt)。它作為轉(zhuǎn)錄后關(guān)鍵的基因表達(dá)調(diào)控子可參與幾乎所有的生理和病理過程,革新了我們對基因表達(dá)調(diào)控的傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)。miRNAs的檢測是其功能研究的基礎(chǔ),但小片段的特性使其檢測十分困難。

            PCR和Northernblot是目前檢測單個(gè)miRNA最廣泛使用的兩種方法。PCR方法敏感性高,但假陽性的憂慮和引物設(shè)計(jì)的困難限制了它的使用。Northernblot是非常有效的檢測工具,但傳統(tǒng)的固相雜交技術(shù)程序復(fù)雜、時(shí)間漫長且操作不便。新出現(xiàn)的液相雜交技術(shù)檢測速度快,但需要特定的熒光信號(hào)檢測儀器。

            方法改進(jìn):我們這里報(bào)道一種新的方法:液相雜交顯色法()。

            這種方法是將提取純化的小RNA與5’端生物素標(biāo)記的DNA探針進(jìn)行液相雜交,接著用核酸外切酶消化多余的探針,再將雜交液點(diǎn)于尼龍膜上,之后ABC孵育,最后BCIP/NBP、DAB或者ECL顯色。

            能夠區(qū)別miRNA家族成員間一個(gè)的差異,其靈敏度可以達(dá)到2.5fmol,全過程耗時(shí)不到3個(gè)小時(shí)。本方法由于整合了快速液相雜交和親和素-生物素信號(hào)放大系統(tǒng)(ABC)兩大技術(shù),不但實(shí)現(xiàn)了miRNA的簡單、快速、高靈敏度檢測,其可視化的信號(hào)目測,還省去了昂貴的信號(hào)檢測儀。此外,本方法簡單的操作流程,使其容易學(xué)習(xí)和方便使用。



          關(guān)鍵詞: miRNA檢測 LHCD 堿基

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